Arquivos microbiologia de alimentos

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Como evitar contaminação cruzada em laboratório de microbiologia?

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O laboratório de microbiologia é responsável por gerar resultados confiáveis, que serão usados para a liberação das vendas dos produtos e para que a alta direção tome decisões que impactam não somente os lucros, a imagem das empresas e o emprego dos colaboradores, mas principalmente a saúde das pessoas.

Portanto, é de responsabilidade do laboratório de microbiologia garantir que resultados negativos sejam realmente negativos e que os presuntivos ou positivos sejam confirmados com precisão, para que as melhores ações corretivas ou recalls sejam iniciados de maneira assertiva, já que há muito em jogo, como altos custos, risco de falência e todo o impacto de causar mal aos consumidores.

Sempre que há uma suspeita, todos os lotes envolvidos devem ser retidos até que tudo esteja esclarecido.

Agora imagine o seguinte cenário: foram realizadas diversas investigações após um resultado positivo, que desencadeou um recall, que caiu na mídia, redes sociais, gerou muitos danos à imagem da empresa, mas sem reclamações de consumidores… e você descobre que a causa-raiz foi uma contaminação cruzada dentro do laboratório de microbiologia e não veio realmente do produto ou processo!

Como explicar isto para o público e para a diretoria? Para evitar este tipo de situação, você deve se perguntar:

Mas de onde poderia vir esta contaminação?

Alguns exemplos que já acompanhei em investigações em diferentes laboratórios de indústrias e prestadores de serviço mostraram que, algumas vezes, contaminações cruzadas começam a partir de derramamento de cepas de referência usadas como controles positivos para as análises diárias, sendo mal manipuladas por analistas que podem estar desatentos, cansados, podem ser novos no time ou mal treinados. Já vi ocorrerem derramamentos de tubos de cepas de controle de qualidade de meios por defeitos em vórtex, outras vezes oriundos de outros positivos previamente identificados na fábrica, por exemplo: swabs de zona 4 ou de matérias-primas (antes de tratamentos térmicos) e que viraram residentes no ambiente por falhas de assepsia, e com mais frequência, positivos oriundos de testes de proficiência realizados no laboratório.

Por isto é muito importante garantir que sejam realizados os treinamentos de boas práticas de laboratório e de biossegurança, para toda a equipe, antes de irem para a bancada – desde o time de limpeza, descontaminação, preparo de meios, analistas e gerentes, para que todos aqueles que acessem o laboratório entendam os conceitos e riscos de eles gerarem uma possível contaminação cruzada (aqui no blog você encontra outros artigos bem legais para entender o conceito: Bactriz e suas aventuras cruzadas! Uma fábula sobre contaminação cruzada de alimentos e Programa de codificação por cores para controle de contaminação cruzada. Ter controle de acesso e travas em locais críticos pode evitar muita dor de cabeça!

Uma técnica que funciona muito bem é filmar o analista, durante sua validação, enquanto ele realiza uma determinada análise e depois, em conjunto com ele, apresentar os pontos de melhoria nas técnicas assépticas. Ter um analista “coach”, mais experiente, que acompanhe as primeiras semanas dos novos analistas também ajuda a evitar falhas.

Ter um plano robusto de monitoramento ambiental no laboratório é tão importante quanto na indústria!

Assim você conseguirá acessar o grau de habilidade dos analistas, durante a realização das análises em não contaminar bancadas, cabines de biossegurança, jalecos, pipetas, agitadores, estufas…Pode parecer estranho, mas não é incomum ocorrerem contaminações cruzadas, mesmo em laboratórios de referência acreditados (e você pode aprender mais sobre como criar planos em: Como desenvolver um plano de amostragem microbiológica para alimentos).

A coleta de amostras para o plano de verificação de limpeza é fundamental para garantir que, se algo escapar, será realmente eliminado. Não deixe de validar seu plano. Considere a frequência e número de amostras com base nas áreas e atividades, conforme os riscos. Importante lembrar que não são só as análises de patógenos que podem causar contaminações cruzadas e que se deve ter os mesmos cuidados para laboratórios que manipulam micro-organismos indicadores.

Crie uma frequência de análise dos resultados dos planos. Recomendo que seja semanalmente, para transformar dados em informação e tomar as ações necessárias a tempo!

Para ter certeza da origem de uma contaminação cruzada é necessário fazer uma investigação com rastreabilidade reversa, entrevistando os analistas dos diferentes turnos envolvidos, coleta de swabs, acessar os registros de resultados de testes e dos planos de monitoramento e verificação e, posteriormente, identificar a cepa positiva, com testes bioquímicos, de sorologia completa ou sequenciamento de DNA para verificar se há ou não diferenças nas cepas…porém são métodos caros, trabalhosos e que demandam vários dias para obtenção dos resultados.

Até lá, seu produto estará retido para venda! Já imaginou o custo? Você tem espaço para armazenar toda produção retida? Ou precisará alugar containers ou até galpões? Algumas vezes, por falta de espaço, é necessário parar a produção, gerando lay-off de operadores, ociosidade de máquinas e se houver matéria-prima perecível, perdas enormes. Em produções puxadas, algumas vezes, a venda é perdida se não for entregue no prazo. Isso pode impactar sua relação com o cliente!

Toda esta avaliação deve fazer parte da análise de risco do laboratório e da fábrica, pois estão intimamente interligados.

Qualificar o time e acreditar o laboratório em ISO 17025 pode parecer caro, mas garanto que é muito mais barato do que realizar um recall!

Cuide bem do seu time e do seu negócio.

Cristina de Abreu Constantino é graduada em Ciências Biológicas, com mestrado em Ciências dos Alimentos pela UNICAMP e MBA em Gerenciamento de projetos pelo IBMEC. Foi gerente de operações de laboratório de microbiologia, engenheira de aplicação e especialista de Pesquisa e Desenvolvimento de produtos. Hoje atua como consultora de segurança dos alimentos.

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Cristina de Abreu Constantino

28 de julho de 20221 de novembro de 2022

Perigos biológicos

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Como desenvolver um plano de amostragem microbiológica para alimentos

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Primeiramente nos perguntamos: por que avaliar a qualidade microbiológica de um alimento? Resposta: para conhecer, entender, identificar, avaliar e prevenir contaminantes até ou além do nível aceitável, obtendo informações como qualidade aceitável ou inaceitável, se está de acordo com a legislação, se é satisfatório ou não e se este alimento pode ser vendido e consumido. A análise microbiológica de alimentos é baseada em riscos, combinando o rigor analítico de um plano de amostragem com o risco para os consumidores decorrentes da possível presença de diferentes microrganismos nos alimentos. A base do conceito, segundo o ICMSF, é que “quanto maior o risco para o consumidor, mais rigorosa deve ser a gestão do perigo envolvido”.

A patogenicidade e gravidade podem diferir entre os microrganismos, assim como as vulnerabilidades dos consumidores em ficarem doentes após a ingestão de um alimento contaminado. Também podem variar as condições em que o alimento foi manipulado e utilizado depois de produzido ou manufaturado, tais como refrigeração e cozimento.

Devemos sempre pensar nos objetivos da análise, que podem ser:

– aceitar ou rejeitar um lote. Para isso, a coleta deve ser aleatória. É preciso decidir sobre o lote e não estimar a qualidade da amostra/tipo de distribuição de microrganismos. Envolve procedimentos de amostragens, coleta e análises, ou seja, não se deve substituir uma avaliação/inspeção sistemática da linha de produção. Para este caso, o plano com “n” reduzido ($) não tem a mesma garantia de um plano com “n” maior;

– estudar cientificamente, com uma coleta podendo ser direcionada;

– identificar causas e problemas, também com coleta podendo ser direcionada;

– controlar processos com coleta aleatória ou direcionada.

Os planos de amostragens para análises microbiológicas em alimentos são aplicáveis, pois não é possível testarmos amostras para todos os patógenos de alimentos, é impraticável testar 100% de um ingrediente ou produto final. A distribuição dos microrganismos não é uniforme e por isto fornecem base estatística para aceitar ou rejeitar o produto. O problema é como correlacionar o desempenho de um plano de amostragem com o nível ou a concentração de um patógeno que seria detectado com uma determinada probabilidade? Faz mais sentido relacionar o desempenho com outras métricas de gestão.

Existem dois tipos de planos de amostragens, por atributos e por variáveis. O “por atributos” classifica como conforme ou não conforme, por exemplo: Salmonella presente ou ausente e mesófilos menor que e maior que. O “por variáveis” é uma medida e a precisão depende do instrumento de medição, por ex.: teor de sal, de vitamina D.

Na estrutura de um plano de amostragem existem diferenças entre os tipos referentes às análises de presença/ausência x plano de amostragem quantitativo e se os planos são de 2 e 3 classes, considerando o lote “N” como o número total de unidades (população) produzidas e manipuladas nas mesmas condições, o valor de “n” como o número de unidades amostrais, retiradas de um ciclo do lote produzido e analisada independentemente e o “c” como o número máximo aceitável de unidade de amostra do lote que excede o número máximo de microrganismos por grama tolerado (número de defeituosos).

Nos planos de 2 classes que aceitam ou rejeitam o lote são realizadas as análises amostrais (n) cujos resultados estarão ou não de acordo com o esperado (m), com análises qualitativas (presença/ausência) ou quantitativas:

Exemplificando plano de amostragem de 2 classes:

Nos planos de 3 classes que aceitam ou rejeitam o lote, são feitas análises amostrais (n) cujo resultado está baseado no número de defeituosos “c” e nos limites quantitativos inferior “m” e superior “M” com análises quantitativas:

Exemplificando um plano de amostragem de 3 classes:

O ponto principal é a capacidade discriminatória que depende do valor de “n”, pois quanto menor “n”, menor o poder de discriminação e n, c, M devem ser estabelecidos em função de: produto, forma de consumos, microrganismos, risco, histórico e grau de proteção.

Post baseado na palestra da Dra. Graciele Viccini Isaka, proferida em 23/02/2022, na II Semana Nacional de Microbiologia de Alimentos na Indústria.

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Cíntia Malagutti

27 de maio de 202226 de maio de 2022

Perigos biológicos

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Quorum sensing, a comunicação das bactérias

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A microbiologia é uma ferramenta indispensável para a indústria de alimentos. Esta ciência atualiza-se a cada dia e cabe aos setores das indústrias se qualificar constantemente. Pensando nisso, a Agron Food Academy lançou a II Semana Nacional da Microbiologia na Indústria (SEMICRO), um evento que traz na sua essência a prática da microbiologia dentro da indústria de alimentos, abordando temas práticos ministrados por profissionais reconhecidos e atuantes no setor. Esta semana ocorreu nos dias 21 a 23 de fevereiro de 2022, com apresentação de 9 palestras e 4 cursos.

A palestra que mais me chamou a atenção foi a ministrada pela Dra. Luciana Maria Ramires Esper, intitulada “Quorum sensing – Aplicação na microbiologia de alimentos”. Essa área de estudos teve início no final da década de 60, devido à observação de características peculiares da bactéria marinha Vibrio Fischeri. Cientistas observaram que a simbiose entre a bactéria V. fischeri e a lula Euprymna scolopes garantia uma bioluminescência ao organismo, sendo capaz de auxiliar na camuflagem ou na atração de presas e em troca, oferecer os nutrientes necessários para o crescimento bacteriano.

A. Vibrio fischeri bioluminescente sob um microscópio e B. Uma lula Euprymna scolopes

Mas foram nas bactérias que o termo ganhou corpo e consolidação. De maneira prática, Quorum Sensing pode ser entendido como Quorum significando número mínimo de participantes e Sensing significando sensor, ou seja, essa comunicação que as bactérias utilizam depende de uma quantidade de bactérias e de sinais que elas transmitem. Se há poucas bactérias, há poucos sinais e a comunicação não acontece. Se há muitas bactérias, há vários sinais e a comunicação acontece. Isso significa que a comunicação depende do acúmulo desses sinais.

A comunicação bacteriana depende de moléculas versáteis de sinalização química chamadas autoindutores, que regulam a expressão do gene bacteriano em um processo conhecido como quorum sensing. O Quorum sensing permite que as bactérias individuais dentro das colônias coordenem e realizem funções em toda a colônia, como esporulação, bioluminescência, virulência, conjugação, competência e formação de biofilme.

Se quiser se aprofundar mais neste assunto, há um Ted Talk super interessante aqui para assistir. Quem quiser, pode entrar na página da Agron Food Academy e se inscrever nas palestras clicando aqui.

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Jacqueline Navarro

27 de abril de 202223 de abril de 2022

Perigos biológicos

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Considerações sobre o efeito térmico na segurança dos alimentos

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O tratamento térmico continua sendo um dos métodos mais importantes utilizados no processamento de alimentos e bebidas para a redução de cargas microbianas e a garantia de alimentos seguros, e adicionalmente, proporciona também alguns benefícios:

Aumento de shelf-life;
Em alguns casos, por exemplo em envases assépticos, propicia a não necessidade de refrigeração, o que ajuda no armazenamento e logística;
Branqueamento, com a possibilidade de inativação de enzimas responsáveis pelo escurecimento;
Destruição de fatores antinutricionais, como inibidores de tripsina em algumas leguminosas;
Aumento da disponibilidade de alguns nutrientes, por exemplo: digestibilidade de proteínas, gelatinização de amidos e liberação de niacina ligada.

No entanto, a aplicação do calor também destrói componentes dos alimentos responsáveis pelo seu sabor, cor ou textura e, como resultado característico, eles são, muitas vezes, percebidos como de menor qualidade ou valor. Por isso, o emprego do calor não pode ser usado indiscriminadamente.

Felizmente, é possível minimizar os efeitos indesejáveis, e ao mesmo tempo potencializar os efeitos desejáveis com a utilização de combinações de temperaturas mais elevadas e tempos menores no processamento térmico, recorrendo-se a tecnologias como a esterilização HTST, entre outras.

O EFEITO DAS ALTAS TEMPERATURAS

Altas temperaturas têm a capacidade de provocar a redução da carga de microrganismos em alimentos, por isso são usadas como método de conservação, garantindo a segurança dos alimentos, sendo tema relevante em Planos HACCP, configurando muitas vezes PCCs.

As temperaturas capazes de provocar uma redução significativa da carga microbiana são denominadas de “temperaturas letais”.

Para que seja efetivo, o calor requer tempo de ação. Assim, normalmente controla-se o binômio tempo/ temperatura, dependente de fatores que definem a intensidade do tratamento e do tempo de exposição ao calor para reduzir uma determinada população microbiana a níveis aceitáveis, portanto, seguros.

Quando os microrganismos são submetidos a temperaturas letais e constantes, podemos observar uma redução no número de microrganismos sobreviventes. A letalidade de um processo térmico representa o número de ciclos logarítmicos reduzidos na população destes microrganismos.

Para uma dada população de microrganismos, submetida a uma temperatura letal constante, o número dos microrganismos viáveis decrescem obedecendo à cinética de primeira ordem, o que significa que uma mesma porcentagem do microrganismo é destruída em um dado intervalo.

Quanto maior a temperatura, maior o efeito da morte pelo calor, assim com o aumento da temperatura o tempo para se conseguir o mesmo efeito diminui.

Por isso, a letalidade requerida para um processo é definida como o tempo necessário em uma temperatura específica, que seja suficiente para reduzir a população de um determinado microrganismo até níveis aceitáveis, ou seja, dentro dos quais um determinado alimento possa ser considerado como efetivamente seguro.

ESTERILIZAÇÃO

Numa pasteurização ocorre a destruição de microrganismos patogênicos não-esporulados, porém, numa esterilização temos um efeito mais enérgico, destruindo também os esporulados. Como resultado, os alimentos esterilizados alcançam uma vida útil maior do que aqueles pasteurizados e podem ser armazenados em temperatura ambiente, como é o caso de alimentos em caixinhas longa vida.

Num contexto geral, na esterilização se utilizam temperaturas acima de 100°C e tempos mais curtos, na pasteurização abaixo de 100°C e tempos mais longos.

Em um processamento térmico, o valor da letalidade de uma esterilização é calculado baseando-se na resistência térmica dos microrganismos ou de seus esporos, conforme a penetração de calor no produto.

Veja que o termo esterilização não significa a destruição de “todos” os microrganismos em um meio, pois como a curva de morte térmica dos microrganismos é logarítmica, não se atinge o zero.

Por isso, na prática, na esterilização comercial de um produto submetido a este processo ainda poderão existir esporos ou mesmo alguns microrganismos, porém estes não se encontram viáveis e em condições para se desenvolver e/ ou causar danos aos consumidores. Por este motivo, não causam transformações no produto final ou doenças em quem consome.

De modo geral a resistência ao calor dos microrganismos está relacionada com suas temperaturas ótimas de crescimento.

Os termófilos são mais resistentes ao calor que os mesófilos, que por sua vez são mais resistentes que os psicrófilos. Já as bactérias formadoras de esporos são mais resistentes que as não esporuladas, sendo as formadoras de esporos termofílicas mais resistentes que as formadoras de esporos mesofílicas.

Também podemos relacionar a coloração de Gram com a resistência ao tratamento térmico, sendo que os microrganismos Gram Positivos tendem a ser mais resistentes que os Gram negativos.

Além disso, o tempo necessário para obter a esterilização comercial de um alimento é influenciado por outros fatores:

Resistência ao calor dos microrganismos ou enzimas que podem estar presentes no alimento;
Condições do aquecimento;
Composição e pH do alimento;
Tamanho e tipo do recipiente;
Estado físico do alimento.

Processamentos com altas temperaturas e tempos curtos (em inglês, high temperature short time: HTST) podem ser utilizados para produzir o mesmo nível de destruição de microrganismos ou enzimas em temperaturas mais baixas durante períodos maiores, porém com uma maior manutenção das características sensoriais e do valor nutricional dos alimentos.

Se quiser se aprofundar este tema, sugiro uma olhada no artigo “Controle em tempo real em um processo de esterilização convencional” no link esterilização e o artigo “Modelamento matemático do processo de esterilização de alimentos condutivos em embalagens de vidro” no link modelagem.

FATORES QUE DEFINEM A RESISTÊNCIA TÉRMICA

Para que se possa estabelecer um processamento térmico adequado para a destruição dos microrganismos, é necessário conhecer a resistência térmica dos microrganismos-alvo. Normalmente, para alimentos que não tem pH abaixo de 4,5, utiliza-se como referência o Clostridium botulinum por ser um patógeno esporulante de alta resistência ou o Clostridium sporogenes, que apesar de ser um deteriorante, é ainda mais resistente que o botulinum.

Essa resistência é influenciada por diferentes fatores como, por exemplo, número de células vegetativas ou esporos, espécie, fase do crescimento e das características do meio (pH, composição do alimento, presença de substâncias inibidoras etc). Os seguintes fatores influenciam na letalidade de microrganismos:

Valor D

Tempo de redução decimal, que é o tempo (em minutos), a uma determinada temperatura, capaz de reduzir 90% dos microrganismos, ou seja, o tempo necessário para a curva de sobreviventes atravessar 1 ciclo log, restando 10% da população inicial de microrganismos;
Dt normalmente é a expressão de D quando determinado à temperatura de 121°C. Assim, em uma contagem inicial de esporos de 100 esporos/mL, após tratamento térmico em um tempo de redução decimal, ou seja, 1 D, a contagem de esporos será reduzida para 10 esporos/mL;
O valor D reflete a resistência de um microrganismo para uma temperatura específica. Quanto maior é o D, mais resistentes são os microrganismos e é necessário mais tempo para destruí-los.

Valor Z

É o aumento de temperatura, necessário para reduzir em 90% o tempo de destruição térmica, ou seja, que ocasione o mesmo efeito letal em um décimo do valor D;
O valor Z reflete a resistência relativa de um microrganismo para diferentes temperaturas destrutivas. Com isto é possível calcular processos térmicos equivalentes sob diferentes temperaturas;
Então, se o valor D é de 10 minutos para uma temperatura de 100ºC, e de 1 minuto para uma temperatura de 120ºC, o valor z é de 20ºC. Os D e Z variam para cada microrganismo e com as condições do meio.

Valor F:

É o tempo, em minutos, em uma determinada temperatura, suficiente para destruir as células ou esporos de um determinado microrganismo;
A eficiência do processo de esterilização determina o número de reduções decimais na contagem de esporos que é obtida em determinado tratamento térmico;
Logo, sendo 10¹² a contagem de esporos iniciais em um produto submetido ao processamento em uma planta com efeito de esterilização igual a 10, a contagem final de esporos será de 10².

Valor B*:

É relacionado com o efeito bacteriológico do processo, ou seja, o efeito letal total integrado no processamento ao qual o produto é submetido.

Valor C*:

É o efeito químico, ou seja, o dano químico total integrado do processamento ao qual o produto é submetido.

Num contexto geral, um processamento de ultrapasteurização UHT (ultra high temperature) é considerado satisfatório quando consegue estabelecer padrões de processo que maximinizem B* e minimizem C*.

FATORES SINÉRGICOS

Existem vários outros fatores que afetam sinergicamente a resistência térmica dos microrganismos ao calor, influenciando na destruição térmica, tais como:

Gordura: Aumenta a resistência térmica dos microrganismos, apresentando efeito protetor;
Sais: Têm efeito variável e dependente do tipo de sal. Alguns sais têm efeito protetor e outros tornam as células mais sensíveis ao calor;
Carboidratos: Sua presença pode causar aumento da resistência dos microrganismos ao calor;
Proteínas: Durante o aquecimento as proteínas têm efeito protetor sobre os microrganismos, ou seja, alimentos com alto teor proteico aumentam a resistência térmica dos microrganismos;
pH: Cada microrganismo possui pH ótimo de crescimento, e são mais resistentes ao calor neste pH. Quanto mais se afasta deste valor de pH ótimo, tanto para cima quanto para baixo, mais aumenta a sensibilidade do microrganismo ao calor;
Idade dos microrganismos: Há uma tendência de as células bacterianas serem mais resistentes na fase estacionária de crescimento, e menos resistentes ao calor na fase logarítmica;
Temperatura de crescimento: Com o aumento da temperatura de incubação cresce a resistência dos microrganismos ao calor;
Compostos inibitórios: Na presença de compostos inibidores de crescimento dos microrganismos, como antibióticos, ocorre uma redução na resistência ao calor;
Efeito de ultrassônicos: Endoesporos bacterianos submetidos a tratamentos ultrassônicos têm menor resistência ao calor.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

BARROS, G.A. Produtos esterilizados. Revista do Instituto de Laticínios Candido Tostes. Juiz de Fora: v. 28, n. 169, p.17-23, 1973.

FELLOWS, P.J. Tecnologia do processamento de alimentos. Porto Alegre. Artmed.2006, 711p.

GAVA, A. J.; SILVA, C.A.B.; FRIAS, J.R.G. Princípio de Tecnologia de Alimentos. Princípios e Aplicações. São Paulo, Nobel, 2009, 512p.

JAY, J.M. Microbiologia de Alimentos. 6° ed. Porto Alegre: Artmed, 2005, 712p.

MASSAGUER, P.R. Microbiologia dos Processos Alimentares. São Paulo: Varela, 2006, 258p.

PENNA, T.C.V.; MACHOSHVILI, I.A. Esterilização térmica. Conceitos Básicos da Cinética de Morte Microbiana. Revista Farmácia Bioquímica. Universidade de São Paulo, (Supl. 1):1-5, 1997.

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Marco Túlio Bertolino

27 de setembro de 202124 de setembro de 2021

Perigos biológicos

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ComBase como ferramenta de microbiologia preditiva em alimentos – II

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Na parte I deste post abordamos as funcionalidades do software Pathogen Modeling Program (PMP) Online. Hoje, falaremos do ComBase, o software de Microbiologia Preditiva mais usado mundialmente, são mais de 70.000 usuários ao redor do mundo.

O ComBase, assim como o PMP, está disponível gratuitamente. O acesso é dependente de login, mas o cadastro é bem simples e fácil de fazer. Após realizar a conexão, você poderá acessar um banco de dados com mais de 60.000 registros do comportamento microbiano em ambientes alimentares. Esse software de microbiologia foi lançado em 2003 e graças a doações tanto de dados que descrevem como os micro-organismos se comportam (crescem, sobrevivem ou morrem em meios de cultura e em alimentos), quanto monetárias ele está cada vez mais útil e funcional. Atualmente, ele é administrado pela Universidade da Tasmânia e pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos – Serviço de Pesquisa Agrícola (USDA-ARS).

A primeira ferramenta disponível do software é o Browser, que realiza a pesquisa em um banco de dados da literatura científica e de diversas instituições que avaliaram o comportamento de micro-organismos deteriorantes e patogênicos em alimentos e em meios de cultura. A busca pode ser feita adicionando-se os campos: Micro-organismo (patógenos, bactérias deteriorantes e bolores e leveduras); Tipo de alimento ou meio de cultura; variadas Condições (exemplos: diferentes concentrações de conservantes, embalados à vácuo e presença de microbiota); várias Propriedades (exemplos: inoculação de esporos, cepas resistentes a antibióticos ou tolerantes a ácidos); Faixas de temperatura, de atividade de água e de pH específicas; por fim, também pode-se restringir a pesquisa por autor.

Já o Broth Models fornece previsões, a partir de modelos matemáticos, baseados em dados selecionados do banco do ComBase, em função de fatores ambientais, como temperatura, pH e atividade de água do meio de cultura. Os tipos de modelos disponíveis são de multiplicação, de inativação térmica e de sobrevivência não-térmica para diversas bactérias, todos baseados em meio de cultura. O resultado da predição, após se completar com os dados desejados de temperatura, pH e atividade de água, será em forma de gráfico e de tabela.

O Food Models permite a predição do comportamento de patógenos nos alimentos. Existem dois modelos disponíveis: Perfringens Predictor prevê a multiplicação de Clostridium perfringens durante o resfriamento de carnes e Salmonella in egg para prever a multiplicação de Salmonella resistente a antibióticos (cepa S. Typhimurium DT104) em produtos líquidos à base de ovos, entre 10 – 42°C.

O DMFit permite que coloquemos nossos dados experimentais de contagens microbianas ao longo do tempo para ajustar esses dados aos modelos de Baranyi e Roberts, trilinear, bifásico ou linear. Após a adição dos dados experimentais, basta clicar no botão FIT e os pontos (contagem microbiana X tempo) serão ajustados aos modelos citados anteriormente. Os resultados são apresentados na forma de gráfico e de tabela. Também pode-se optar por trocar o modelo apresentado e os parâmetros serão recalculados automaticamente.

Em Resources há uma lista bastante útil de outras ferramentas de microbiologia preditiva disponíveis. Finalmente, em Help você pode aprofundar os conhecimentos e sanar dúvidas sobre todas as ferramentas do Combase citadas aqui no post, bem como assistir a tutoriais que explicam o passo a passo do uso do software.

Apesar de poder assustar um pouco no começo, essas ferramentas disponíveis gratuitamente trazem uma interface amigável à microbiologia preditiva.

Agora chega de teoria, acesse os sites do PMP e do ComBase e veja como esses softwares são fáceis de usar e acessíveis a partir de um simples clique!

Referências:

Baranyi J. and Roberts T.A. (1994). A dynamic approach to predicting bacterial growth in food. Int. J. Food Microbiol. 23, 277-294.

Baranyi J. and Tamplin M. (2004). ComBase: A Common Database on Microbial Responses to Food Environments. J. Food Prot. 67(9):1834-1840.

McMeekin J., Baranyi J., Zwietering M., Ross T., Dalgard P., Bowman J. and Kirk M. (2005). Information systems in food safety management. Int. J. Food Microbiol. 112, 181–19

3 min leituraNa parte I deste post abordamos as funcionalidades do software Pathogen Modeling Program (PMP) Online. Hoje, falaremos do ComBase, o software de Microbiologia Preditiva mais usado mundialmente, são mais de […]

Susana Elias

13 de maio de 20215 de julho de 2021

Inovações e novidades

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PMP como ferramenta de microbiologia preditiva em alimentos

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Conceitos gerais e algumas aplicações da Microbiologia Preditiva foram abordadas neste post. Relembrando: a Microbiologia Preditiva expressa o comportamento microbiano – tanto de deteriorantes, quanto de patógenos – por meio de modelos matemáticos (fórmulas), levando em consideração os principais fatores para multiplicação, inativação ou sobrevivência desses micro-organismos, como, por exemplo, atividade de água, pH e temperatura.

O fato do desenvolvimento da Microbiologia Preditiva necessitar de conhecimentos em matemática, em informática e em estatística, além da própria microbiologia, acaba afastando muitas pessoas dessa incrível ferramenta. Por isso, hoje, vamos apresentar um software, disponível gratuitamente, fácil de usar e acessível a partir de um simples clique!

Estamos falando do Pathogen Modeling Program (PMP) Online, desenvolvido pelo Departamento de Agricultura e Serviço de Pesquisa Agrícola dos EUA (USDA-ARS), no início dos anos 90. Os tipos de modelos disponíveis são: multiplicação (Growth), sobrevivência (Non-Thermal Inactivation), inativação (Thermal Inactivation) e resfriamento (Cooling). Esses modelos são gerados a partir de meios de cultura e de alimentos específicos (maioria são matrizes cárneas), principalmente envolvendo o comportamento de patógenos. Em toda a previsão que será feita há uma referência dos estudos utilizados para determinar o comportamento microbiano.

Para escolher um modelo adequado à situação para a qual você gostaria de predizer a multiplicação, a inativação ou a sobrevivência de um micro-organismo, primeiramente tente encontrar um modelo que caracterize o desenvolvimento da bactéria no alimento desejado. Considere a microbiota, como por exemplo, o modelo de Multiplicação de Salmonella Typhimurium em carne de frango moída com microbiota (Growth of Salmonella Typhimurium in Ground Chicken with Competitive Microflora). Em muitos casos, você não encontrará um modelo que corresponda exatamente à formulação do seu produto. Assim, é melhor escolher um modelo em meio de cultura (broth culture). Porém, leve em consideração que modelos desenvolvidos em meios de cultura e sem microbiota, geralmente apresentam multiplicação mais rápida dos micro-organismos, quando comparados aos modelos construídos a partir de experimentos realizados em alimentos com microbiota.

Além disso, quando for possível escolher ambientes com ou sem oxigênio, escolha um modelo anaeróbico se o seu produto for embalado a vácuo. Por outro lado, escolha um modelo aeróbio se quiser entender como as bactérias reagirão quando a embalagem for aberta e exposta ao oxigênio. Geralmente, quando as bactérias podem crescer em condições aeróbias ou anaeróbicas, o crescimento é mais rápido em condições aeróbias.

Por fim, após escolher todos os parâmetros para realizar a predição, você só vai precisar clicar no botão Calculate (calcular). O resultado aparecerá em forma de gráfico e de tabela. Também alguns modelos trazem Limites de Confiança Superior (UCL) e Inferior (LCL), que indicam a variação nas previsões com nível de confiança de 95% ou de 99%; por precaução use o UCL. Nos modelos de multiplicação, para obter uma previsão mais segura, escolha a opção “no lag”, ou seja, que não considera a fase lag (tempo necessário para a bactéria se adaptar ao ambiente e começar a se multiplicar).

Todas essas previsões, realizadas usando o PMP, são específicas para as cepas bacterianas e os ambientes usados para gerar os modelos. Assim, não se pode garantir as previsões para outras cepas e outros ambientes, sem que sejam realizados estudos de validação adequados. Além disso, é importante ressaltar que as previsões do comportamento microbiano não são 100% precisas. Variações e incertezas são introduzidas por meio de erros experimentais e ajustes dos modelos primários e secundários. Mesmo assim, a utilização da Microbiologia Preditiva é uma importante estratégia para gestão da segurança de alimentos.

Na parte II desse post apresentaremos o ComBase (https://www.combase.cc/index.php/en/), o software mais usado mundialmente!

Referências

ICMSF(1996) Microorganisms in Foods 5: Characteristics of Microbial Pathogens, Roberts, T. A., Baird-Parker, A. C. and Tompkin, R. B. (eds.), Blackie Academic & Professional, London [ISBN 0 412 47350 X]

Oscar T.P. (2006) Validation of a Tertiary Model for Predicting Variation of Salmonella Typhimurium DT104 (ATCC 700408) Growth from a Low Initial Density on Ground Chicken Breast Meat with a Competitive Microflora. Journal of Food Protection 69(9):2048-2057

Whiting, R. C. 1995. Microbiological modeling. CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 35:467-494.

US Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Eastern Regional Research Center, Wyndmoor, Pennsylvania, USA. PMP online. www.arserrc.gov/mfs/pathogen.htm.

3 min leituraConceitos gerais e algumas aplicações da Microbiologia Preditiva foram abordadas neste post. Relembrando: a Microbiologia Preditiva expressa o comportamento microbiano – tanto de deteriorantes, quanto de patógenos – por meio […]

Susana Elias

3 de maio de 20215 de julho de 2021

Perigos biológicos

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Por que funis descartáveis são alternativas interessantes para análises microbiológicas?

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Funis reutilizáveis e descartáveis são ambas opções viáveis para análises microbiológicas. Produtos de uso único, single-use, são indiscutivelmente mais convenientes, precisos e seguros, embora funis reutilizáveis pareçam ser mais baratos e gerar menos resíduos. Esses prós e contras levaram algumas equipes a permanecer com os funis reutilizáveis. No entanto, análises detalhadas estão desafiando os benefícios associados ao uso de funis reutilizáveis, mostrando que dispositivos descartáveis são melhores alternativas.

Conveniência e flexibilidade

A conveniência dos funis descartáveis é uma de suas maiores vantagens, e um fator que os torna mais convenientes é a facilidade de uso. A filtração e a transferência de membranas para placas são mais fáceis ao trabalhar com este tipo de sistema, ao ponto em que mesmo pessoas sem experiência prática possam realizar o processo. Com este tipo de dispositivo, não há risco de ruptura ou ondulações na membrana, o que geralmente resulta em falsos negativos.

O segundo fator chave que torna os funis descartáveis mais convenientes está relacionado à eliminação das etapas de limpeza e esterilização necessárias no fluxo de trabalho. Uma empresa que normalmente analisa 10 amostras por dia pode ter 12 funis reutilizáveis, o que dá à empresa a capacidade de sempre ter acesso a funis limpos e estéreis em dias normais. No entanto, se essa empresa de repente precisar analisar 20 amostras em um prazo apertado, com o processo de limpeza e esterilização levando de uma a duas horas, faltaria acesso à quantidade suficiente de funis estéreis.

Esse é um exemplo pontual de um problema de rotina associado ao uso de funis reutilizáveis. Por outro lado, funis descartáveis sempre estão prontos para uso. O resultado é que empresas que utilizam esses funis terão maior flexibilidade, podendo rapidamente aumentar a capacidade para atender as mudanças na demanda.

Custo e desperdício

A eficiência operacional proporcionada pelos funis de uso único é um fator que compensa o gasto extra com os produtos em si.

Outro fator é a redução de gastos em outras áreas. Empresas que usam funis reutilizáveis precisam de autoclaves e outras peças de equipamentos para limpeza e esterilização. Além disso, elas também precisam gastar mais com eletricidade e outros recursos humanos necessários para limpar e esterilizar funis reutilizáveis.

Comparação de gastos entre funis descartáveis e reutilizáveis. Embora a quantidade de funis single-use seja maior, os funis reutilizáveis estão associados a gastos indiretos, como eletricidade, água e equipamentos.

Esses fatores neutralizam os benefícios ambientais associados aos funis reutilizáveis. Embora funis descartáveis possam parecer um acúmulo de resíduos à primeira vista, eles são compostos de materiais recicláveis e não possuem impactos ambientais ocultos, ao contrário dos reutilizáveis.

Além disso, empresas que consideram os custos ambientais de autoclavação, flambagem ou imersão em água fervente para serem mais ecológicos, ao invés de focar apenas a redução do descarte de sólidos, tendem a estabelecer uma imagem mais verdadeira de seu impacto no mundo.

Precisão e reprodutibilidade dos resultados

Uma análise mais realista de custo e desperdício precisa considerar também a reprodutibilidade e precisão dos resultados com produtos reutilizáveis e descartáveis.

Toda análise microbiológica realizada com funis descartáveis começa com um produto estéril que não trará fatores de variação. Isso significa que os resultados gerados devem apresentar maior reprodutibilidade.

O processo de limpeza introduz o risco de interferência com as amostras, devido a resíduos de sanitizantes. Detergentes a base de nitrato apresentam um problema em particular, uma vez que seus resíduos podem impedir o crescimento microbiológico. Além disso, existe também a possibilidade de o processo de esterilização falhar ao erradicar todos os microrganismos, criando um risco de contaminação que interfere com os resultados. Desgastes no funil e a qualidade da membrana utilizada também são fatores que podem levar a um desvio nos resultados.

Embora funis reutilizáveis possam entregar resultados precisos e reprodutíveis, esses riscos existem e são difíceis de quantificar, tornando os funis de uso único boas alternativas. Se uma equipe é incapaz de garantir reprodutibilidade dos resultados, é provável que existam custos adicionais e que eles não alcancem os padrões determinados pelo cliente.

Segurança do operador

O último pilar de benefícios do uso de funis descartáveis é a segurança. A limpeza e a esterilização apresentam riscos para o operador, mais especificamente durante o processo de flambagem, que pode resultar em eventos graves de segurança.

A formação de bolhas na pele é o risco de segurança mais comum. Elas parecem quando o operador segura o funil durante o processo de flambagem, mas não percebe que o aço inox aquece a uma temperatura capaz de ferir a pele. Operadores também já queimaram seus braços durante a flambagem e, ainda mais preocupante, o processo de flambagem aumenta os riscos de incêndio.

Funis de uso único não apresentam esses riscos. Operadores podem simplesmente descartá-los após o uso, eliminando os riscos associados à flambagem e outros processos de esterilização. O resultado é que funis descartáveis promovem um ambiente de trabalho mais seguro.

Conclusão

A conveniência, precisão e segurança dos funis descartáveis torna esses produtos adequados às necessidades de laboratórios de análises microbiológicas. Escolher funis de uso único permite que equipes tenham o produto em mãos sempre que precisarem, entregando resultados precisos e reprodutíveis, atingindo excelência em registros de segurança e contribuindo com as iniciativas sustentáveis.

Conteúdo fornecido pela Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha. Edição por Ana Beatriz Batista A B Pereira. Para mais informações sobre este artigo, por favor entre em contato com a Equipe Merck Brasil (biomonitoringbra@merckgroup.com).

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30 de julho de 202013 de janeiro de 2021

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Salmonelose pode ser gatilho para Alzheimer e Parkinson

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Aqui no blog já falamos de sequelas e desdobramentos de doenças de origem alimentar, que vão muito além dos “banais” sintomas gastrointestinais, que não chegam ao extremo da morte, mas podem deixar sequelas por toda a vida. Novos estudos publicados no PLoS Pathogens apontam que patógenos podem estar envolvidos no gatilho Alzheimer e Parkinson em infectados.

Qual é a conexão com a salmonelose, já que essas doenças neurodegenerativas são autoimunes e influenciadas por fatores genéticos? A ciência ainda está buscando essa resposta, mas parece haver um gatilho dentro do intestino.

Bem, primeiro devemos saber que existem proteínas amilóides que são inimigas dos tecidos nervosos, pois elas vão se acumulando em placas e formando agrupamentos que podem bloquear a sinalização entre as células nas sinapses. Elas também podem ativar as células do sistema imunológico que causam inflamações e limpam células deficientes e estão presentes em pacientes de Alzheimer e Parkinson.

Outra coisa que já parece ter sido explicada é o papel da flora intestinal na produção de proteínas amilóides. Foi demonstrado que as bactérias que povoam a microbiota intestinal podem liberar quantidades significativas de amilóides e lipopolissacarídeos, que podem desempenhar um papel na modulação das vias de sinalização e na produção de citocinas pró-inflamatórias relacionadas à patogênese da doença de Alzheimer.

Agora, sobre o estudo mais específico envolvendo Salmonella Typhimurium, isolada de alimentos: nos intestinos dos ratos, a Salmonella Typhimurium produz amilóides do tipo curli no ceco e no cólon. Isso aumentou a inflamação das articulações e as interações de propagação cruzada entre amilóides bacterianas e amilóides humanas, que podem desencadear reações autoimunes semelhantes, como a doença de Alzheimer.

Como já publicamos aqui, no post: Está com artrite reativa? Pode ter sido algo que você comeu, cerca de 5% dos pacientes que contraem salmonelose desenvolvem uma condição autoimune chamada artrite relativa. Alguns pacientes permanecem sintomáticos por 5 anos ou mais. A adaptadíssima Salmonella Typhimurium forma biofilmes de compostos de curli, que são “fibras amilóides finas e altamente agregadas” de celulose, BapA e DNA extracelular que protege o patógeno do estresse ambiental.

Este estudo foi o primeiro a mostrar que patógenos de origem alimentar podem produzir essas proteínas amilóides no intestino. Os ratos estudados desenvolveram artrite reativa dentro de seis semanas após a infecção.

Os pesquisadores esperam em seguida confirmar que esse desenvolvimento também ocorre nas pessoas. Eles afirmam que: “Como os amilóides também são produzidos pelas bactérias comensais, é possível que a liberação não intencional de amilóides produzidos pela microbiota possa desencadear reações autoimunes semelhantes”.

Tem interesse em saber sobre mais desdobramentos complexos de doenças de origem alimentar?

Leia estes posts:

http://foodsafetybrazil.org/doencas-transmitidas-por-alimentos-podem-ter-consequencias-por-toda-a-vida/

https://foodsafetybrazil.org/doencas-transmitidas-por-alimentos-que-deixaram-sequelas-graves-casos-reais/

https://foodsafetybrazil.org/campylobacter-as-sequelas-de-uma-vitima-com-guillain-barre/

https://foodsafetybrazil.org/depoimentos-de-brasileiros-vitimas-da-sindrome-de-guillian-barre/

Contribuiu com esclarecimentos técnicos a Dra Alice Moreira Capretz.

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Juliane Dias

23 de julho de 202013 de janeiro de 2021

Perigos biológicos

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Bactérias Gram positivas e Gram negativas: o que isso quer dizer?

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Em qualquer bate papo sobre o assunto, sempre tem alguém dizendo que a bactéria tal é gram-positiva e a outra é gram-negativa, mas você sabe o que isso significa de fato? Venha com a gente entender qual a diferença entre elas e por que é importante saber essa classificação.

Bactérias são seres vivos unicelulares (são constituídos somente de uma célula) e procariontes, isto é, não possuem membrana nuclear envolvendo seu material genético. Algumas bactérias são causadoras de doenças, no entanto existem bactérias que possuem grande importância ecológica, como as bactérias fixadoras, que participam do ciclo do nitrogênio, ou as decompositoras, importantes em diversos processos produtivos de alimentos.

Imagem 1 – Estrutura típica de uma bactéria

Existem, porém, algumas particularidades entre as bactérias e a fim de diferenciá-las foi criado o método chamado GRAM.

Chama-se coloração de Gram o método de coloração utilizado para diferenciar espécies bacterianas em dois grupos, bactérias gram-positivas e gram-negativas.

Entre os fatores que irão diferenciar gram-positivos de gram-negativos, estão a coloração das bactérias, a composição e propriedades químicas e físicas das paredes celulares.

Christiam Gram notou que as bactérias podiam ser coradas de azul ou vermelho devido à precipitação do cristal violeta com lugol no interior do citoplasma da célula.

Os organismos Gram-positivos possuem uma parede celular grossa envolvendo a membrana citoplasmática que é composta por peptideoglicanos e ácidos teicoico.

Imagem 2 – Estrutura da parede celular – Bactéria Gram Positiva

Os organismos Gram-negativos possuem uma parede celular mais fina que é envolvida por outra membrana externa, portanto os gram-negativos possuem 2 membranas, a externa difere da interna e contém moléculas de lipopolissacarideos.

Imagem 3 – Estrutura da parede celular – Bactéria Gram Negativa

Exemplos de bactérias Gram-positivas

Bacillus, Nocardia, Clostridium, Propionibacterium, Actinomyces, Enterococcus, Cornyebacterium, Listeria, Lactobacillus, Gardnerella, Mycoplasma, Staphylococcus, Streptomyces, Streptococcus.

Exemplos de bactérias Gram-negativas

Escherichia, Helicobcater, Haemophilus, Neisseria, Klebsiella, Enterobacter, Chlamydia, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Vibrio, Treponema

Por que é importante saber se a bactéria é gram-positiva ou negativa?

É o tipo de parede e portanto, a definição se a bactéria é gram-negativa ou gram-positiva que vai definir a eficácia dos agentes físicos e químicos utilizados para eliminar, controlar ou aumentar o crescimento das bactérias conforme a necessidade. Em food safety, geralmente queremos eliminar ou reduzir as bactérias a quantidades aceitáveis. Mesmo que nem todas possam ser diferenciadas pela coloração de Gram, com certeza a metodologia tem grande aplicação para food safety.

A técnica de coloração das bactérias ajuda a reconhecer as características de cada caso de infecção e determinar os tratamentos mais convenientes. Cerca de 90 a 95% das bactérias Gram-negativas são patogênicas e muitas Gram-positivas são não patogênicas e algumas, inclusive, são úteis. As paredes mais complexas das bactérias Gram-negativas as tornam mais resistentes e dificultam que os antibióticos e outros medicamentos adentrem em seu interior. Além disso, as bactérias Gram-negativas geralmente são mais ameaçadoras do que as Gram-positivas por terem uma maior virulência e serem ou se tornarem mais facilmente resistentes aos antibióticos. A técnica de Gram tem também uma grande importância clínica porque permite que as bactérias associadas a infecções sejam prontamente caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas, o que permite monitorar a infecção e adotar certas opções de tratamento, mesmo antes que seja feita uma cultura.

O peptideoglicano, por exemplo, é o sitio de ação da penicilina, isso explica por que os antibióticos são mais efetivos contra Strepto e Estaphilo (G+) do que contra E. coli (G-), por exemplo.

E como é feita a técnica de Gram?

Quando coloridas por um corante adequado e levadas ao microscópio, pode-se diferenciar dois tipos distintos de bactérias: as chamadas Gram-positivas e as Gram-negativas. Elas são assim chamadas porque foi o médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, em 1884, quem elaborou o processo de colorir e descolorir as bactérias. Bactérias Gram-positivas são aquelas cujas paredes celulares não perdem a cor azul-arroxeada quando submetidas a um processo de descoloração depois de terem sido coloridas pela violeta de genciana. As que assumem um tom róseo-avermelhado quando submetidas ao mesmo processo são ditas Gram-negativas. Christiam Gram notou que as bactérias podiam se coradas de azul ou vermelho devido a precipitação do cristal violeta com lugol no interior do citoplasma da célula.

Por que este método cora algumas bactérias em violeta e outras em vermelho?

Isso ocorre devido às diferenças de estruturas químicas da superfície bacteriana e da composição da parede celular. As bactérias Gram-negativas contêm uma concentração mais elevada de lipídeos, quando comparadas com as Gram-positivas; suas paredes são, também, mais finas do que as paredes celulares de bactérias Gram-positivas. Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool-cetona extrai os lipídeos, resultando em uma permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas. Assim, o complexo cristal violeta pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. A parede celular das bactérias Gram-positivas, em virtude de sua composição diferente (menor conteúdo de lipídeos), torna-se desidratada durante o tratamento com álcool-cetona reduzindo a permeabilidade e portanto, o complexo cristal violeta não pode ser extraído.

Passo a passo resumido da metodologia de Gram

Cubra o esfregaço com violeta-de-metila e logo após deixe por aproximadamente 15 segundos;
Adicione igual quantidade de água sobre a lâmina coberta com violeta-de-metila e então deixe agir por mais 45 segundos;
Escorra o corante e lave em um filete de água corrente; cubra a lâmina com lugol diluído (1/20) e deixe agir por aproximadamente 1 minuto;
Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente;
Adicione álcool etílico (99,5º GL) sobre a lâmina, descorando-a, até que não desprenda mais corante;
Lave em um filete de água corrente;
Cubra a lâmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos;
Lave em um filete de água corrente;
Deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente com o auxílio de um papel de filtro limpo;
Visualize no microscópio. Logo após leia em objetiva de imersão (100 X).

Referências:

ABCMED, 2014. Bactérias Gram-positivas e Gram-negativas: o que são? Como é a técnica de Gram? Quais as vantagens de diferenciar as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas?. Disponível em: <https://www.abc.med.br/p/587007/bacterias-gram-positivas-e-gram-negativas-o-que-sao-como-e-a-tecnica-de-gram-quais-as-vantagens-de-diferenciar-as-bacterias-gram-negativas-e-gram-positivas.htm>. Acesso em: 3 fev. 2020.
https://www.infoescola.com/microbiologia/bacterias-gram-positivas-e-gram-negativas/
Ministério da Saúde. Técnica de Coloração de GRAM

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Juliana Barbosa

15 de julho de 20204 de junho de 2021

Perigos biológicos

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Microbiologia Preditiva: Conceitos e aplicação em produtos lácteos

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A microbiologia preditiva é uma área da microbiologia que utiliza modelos matemáticos baseados em dados experimentais tais como atividade de água, pH, temperatura, entre outros, para modelar as curvas de crescimento ou diminuição de concentração dos micro-organismos em determinado alimento. Dessa forma, ela permite prever o comportamento dos micro-organismos no alimento durante a sua vida de prateleira comercial, ou ainda o melhor tratamento do alimento para garantir sua segurança.

Existem três tipos de modelos preditivos: o modelo primário, que gera curvas (de temperaturas diferentes) em um gráfico de concentração do micro-organismo (UFC/mL) por tempo (minutos), sem levar em consideração as variáveis do ambiente; o modelo secundário, que explica como a curva do gráfico primário varia conforme os diferentes ambientes podem se alterar, tais como pH, temperatura, etc., pois as atividades metabólicas dos micro-organismos podem acelerar ou desacelerar conforme aumentam ou diminuem algumas dessas variáveis, e os valores podem ser verificados experimentalmente; e o modelo terciário, que pode combinar os dois primeiros, utilizando softwares para calcular como o micro-organismo se comportará, visando a predição de seu comportamento conforme as mudanças dos fatores externos, utilizando as equações do primário e do secundário e calculando as suas probabilidades de adequação.

Ao se analisar os diferentes modelos preditivos para um conjunto de dados de decaimento microbiano em uma matriz láctea, pode-se verificar principalmente qual é o modelo que tem o maior valor de R2 (coeficiente de ajuste, que varia de 0 a 1, indicando percentualmente o quanto os dados obtidos correspondem ao modelo), pois quanto mais próximo este coeficiente estiver de 1 significa que os dados obtidos estarão mais ajustados ao modelo de decaimento do micro-organismo frente às condições impostas pelo tratamento. Também são utilizados o fator bias (que representa o quanto os valores preditos estão na região segura ou insegura da predição) e o fator exatidão (que indica a precisão dos valores preditos em relação aos encontrados experimentalmente).

Ainda na década de 80, foram criados os primeiros softwares para modelagem preditiva de micro-organismos em alimentos. Com relação aos produtos lácteos, existe um de microbiologia preditiva próprio para se avaliar quantitativamente o risco biológico em produtos lácteos, o Dairy Products Safety Predictor, onde se pode especificar o produto lácteo e o micro-organismo estudado, simulando distintos cenários. A partir disto, pode-se obter uma estimativa do risco à saúde humana proveniente de uma possível infecção, toxi-infecção ou intoxicação alimentar. O uso da microbiologia preditiva no processamento de produtos lácteos tem sido relatado com êxito em vários exemplos na literatura científica, o que demonstra sua utilidade e aptidão para atender os anseios da indústria de leite e derivados.

O consumo de leite e derivados encontra-se em crescimento no Brasil e no mundo, e por esta razão, a microbiologia preditiva deve ser utilizada sempre para o auxílio nas pesquisas da segurança dessa categoria de produtos. A microbiologia preditiva constitui-se uma das ferramentas mais seguras para se calcular o tempo de prateleira de um alimento, como também para se calcular as melhores formas de inibir o crescimento de patógenos, garantindo assim a segurança do alimento, embora ainda não se consiga prever todas as suas variáveis, como por exemplo, a interação com outros micro-organismos. Novos estudos devem ser realizados para o aperfeiçoamento dos modelos preditivos já existentes.

Referências

Baranyi, J. & Roberts, T.A. (1994): A dynamic approach to predicting bacterial growth in food. International Journal of Food Microbiology. 23, 277-294.

Cruz, A., Oliveira, C., Corassin, C. H., & Sá, P. (2018). Microbiologia, Higiene e Controle de Qualidade no Processamento de Leite e Derivados. Rio de Janeiro: Elsevier. 356 pp.

Geeraerd, A. H., Valdramidis, V. P., & Van Impe, J. F. (2005). GInaFiT, a freeware tool to assess non-log-linear microbial survivor curves. International Journal of Food Microbiology, 102, 95-105.

Melo, E. S. de, Amorim, W. R. de, Pinheiro, R. E. E., Nascimento Corrêa, P. G. do, Carvalho, S. M. R. de, Santos, A. R. S. S., … & Sousa, F. V. de (2018). Doenças transmitidas por alimentos e principais agentes bacterianos envolvidos em surtos no Brasil. PUBVET, 12, 131.

Oliveira, R. B., Baptista, R. C., Chincha, A. A., Conceição, D. A., Nascimento, J. S., Costa, L. E., … & Sant’Ana, A. S. (2018). Thermal inactivation kinetics of Paenibacillus sanguinis 2301083PRC and Clostridium sporogenes JCM1416MGA in full and low fat “requeijão cremoso”. Food Control, 84, 395-402.

Portela, J. B., Coimbra, P. T., Cappato, L. P., Alvarenga, V. O., Oliveira, R. B. A., Pereira, K. S., Azeredo, D. R. P., Sant’Ana, A. S., Nascimento, J. S., & Cruz, A. G. (2019). Predictive model for inactivation of Salmonella in infant formula during microwave heating processing. Food Control, 104, 308-312.

Schlei, K. P., Reiter, M. G. R., Bertoli, S. L., Licodiedoff, S., de Carvalho, L. F., & de Souza, C. K. (2018). Microbiologia Preditiva: Aspectos Gerais e Tendências. Revista Eletrônica Perspectivas da Ciência e Tecnologia, 10, 52.

Autores: Roberto P. S. Pires (1), Gustavo L. P. A. Ramos (1,2), Janaína S. Nascimento (1), Adriano G. Cruz (1)*

1 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ), Departamento de Alimentos

2 Universidade Federal Fluminense (UFF), Faculdade de Medicina Veterinária

3 min leituraA microbiologia preditiva é uma área da microbiologia que utiliza modelos matemáticos baseados em dados experimentais tais como atividade de água, pH, temperatura, entre outros, para modelar as curvas de […]

Convidados

7 de outubro de 201913 de janeiro de 2021

Food Safety no Mundo

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A distribuição desafiadora de patógenos em alimentos

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Não é raro que, ao ter que notificar um colega, ou um cliente, ou um fornecedor de que, depois de uma análise de laboratório, o resultado está fora da especificação, o retorno impulsivo de quem recebe a informação seja: “mas você já analisou de novo?”. Normalmente, expressar um resultado sensível como este envolve uma rotina de revisão de tudo que foi feito durante a análise, visando garantir a qualidade dos dados gerados. O que vem à frente é um impasse, uma vez que é difícil ligar a incidência do contaminante ao processo produtivo.

Muitas vezes, há uma questão intangível que envolve a maneira como este contaminante está distribuído, razão pela qual pode-se propor um exercício: assumindo que um grão de açúcar possui uma abertura média em torno de 0,9 mm, ou seja, uma área de 2,5 mm², enquanto uma bactéria como a Salmonella tem um comprimento aproximado de 2 a 5 mícrons (10^-6 m) além de largura estimada em 0,7 a 1,5 mícrons, pode-se calcular, de maneira estimada, que seriam necessárias milhões de células desse microrganismo para cobrir por completo um único grão de açúcar. Assim, o número de bactérias necessário para que se observe homogeneidade na contaminação de um lote seria inimaginável.

Para nossa sorte, e devido aos cuidados cada vez mais aperfeiçoados em controle de higiene e processos, dificilmente existem estas concentrações de bactérias nos ambientes de fabricação, o que faz com que os eventos de contaminação sejam extremamente pontuais, ficando, em muitos casos, localizados em momentos críticos de intervenção mal planejada, início e parada de produção ou em momentos e condições potenciais de recontaminação.

Procurar por contaminantes – de natureza química, biológica ou mesmo física, em alguns casos – em locais ou materiais controlados, pressupõe que a distribuição deste agente será rara. No caso da microbiologia, soma-se a isso o fato de os alimentos apresentarem diversos tipos de barreiras que impedem o crescimento microbiano uniforme, bem como o fato de que a bactéria só consegue se locomover em meio líquido – quando consegue, uma vez que existem microrganismos sésseis. Justamente por ser um cenário excepcional, os laboratórios devem tratar a distribuição do contaminante como aleatória, e não como homogênea.

Este é o pano de fundo que pode explicar por que um resultado do laboratório de Microbiologia varia: encontrei uma contagem elevada de indicadores em uma amostra e, ao analisar a contraprova, esta contagem estava consideravelmente mais baixa. O que fazer neste cenário?

Pode-se imaginar um exercício de empatia: se eu lhe oferecesse um pedaço de pizza e dissesse que, dos oito pedaços, um está contaminado, você comeria? E se eu lhe dissesse que são quatro, de oito, os pedaços contaminados? Pode-se modificar a pergunta para: um resultado dentro de norma pode anular um resultado fora de norma obtido anteriormente?

Lidar com um resultado inesperado é uma grande oportunidade de questionar status e propor melhorias: um contaminante microbiológico é capaz de lançar luz a condições também inesperadas de processo, e/ou de laboratório, e/ou de utilidades, e/ou de boas práticas de fabricação, de maneira que ao fechar os olhos para esta informação ou, ainda, ao esperar uniformidade da contaminação e dos resultados para agir, corre-se o risco de começar tarde demais a cuidar deste problema.

Num cenário onde todos estamos, juntos, buscando perfeição em Segurança dos Alimentos, gerar uma informação tão sensível, que pode alertar para uma questão como esta, é de extremo valor. Contudo, saber absorver, tratar essa informação e tomar decisões que preservam a saúde de um consumidor é o que nos deixará mais perto ou mais longe desta excelência.

Por Felipe Zattar, Especialista Técnico da divisão 3M Food Safety

3 min leituraNão é raro que, ao ter que notificar um colega, ou um cliente, ou um fornecedor de que, depois de uma análise de laboratório, o resultado está fora da especificação, […]

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20 de agosto de 201913 de janeiro de 2021

Perigos biológicos

3 min leitura

Especialistas contam o que não comem fora de casa

3 min leitura

Desde a escola, passando pela universidade, trabalho, pelos almoços de domingo na casa dos avós, a comida é o elo entre os humanos. Comemos para celebrar, para esquecer, tem gente que come por necessidade biológica, tem outros que comem por prazer.

Muitas vezes, a correria do dia-a-dia impede que as pessoas estejam em casa na hora de realizar suas refeições. Às vezes, por causa dessa pressa, as pessoas optam por consumir um alimento ou bebida de forma rápida, nas ruas mesmo. Você já saiu de casa e teve que fazer uma rápida refeição na barraquinha da tia que fica na frente do metrô, não é mesmo? Quem nunca? E neste momento, seu cérebro faz uma coletânea de momentos falando que isso pode ser ruim para você, muito ruim mesmo.

Eu, Jacqueline Navarro, como cidadã, não como na rua o famoso churrasquinho grego que se vende no centro da cidade de São Paulo. Ele fica girando incansavelmente em um espeto, sem nenhuma proteção, de cara para a rua!! Eu tenho muita vontade de comer, mas o que me falta é a coragem mesmo. Mas o que eu como sem medo algum é frutas sem lavar.

Diante disto, entrevistamos profissionais ligados à área de microbiologia ou áreas correlatas, unindo informações do Oiapoque ao Chuí para saber deles o que não comem na rua e o motivo. Conversamos com uma pós-doutora em microbiologia de alimentos, um mestrando de microbiologia e uma médica veterinária agente da vigilância sanitária.
A professora Tereza Cristina de Oliveira, da Universidade Estadual de Londrina, conta que quando está em sua cidade natal, Londrina, não tem restrições sobre o que come fora de casa. Frequenta os mesmos restaurantes e almoça diariamente em self-service. Mas quando viaja a história é outra: segundo ela, as doenças de origem alimentar mais comuns ocorrem com maior frequência quando saímos do nosso habitat e entramos em contato com uma nova microbiota. A chamada “doença dos viajantes” é a prova disso. “Quando viajo não como alimentos de origem animal crus. Gosto muito de kibe cru, sashimi, sushi e ceviche de peixe e frutos do mar, mas só consumo esses alimentos em casa ou em restaurantes que estou acostumada a frequentar em Londrina. Outro cuidado que tenho quando viajo é com a água (só bebo engarrafada) e com o consumo de hortaliças folhosas, frutas fatiadas, saladas mistas cruas ou cozidas muito manipuladas, alimentos não industrializados vendidos nas praias (por exemplo, ostras e salgadinhos) e sanduíches frios prontos para consumo”.

Já o mestrando Pedro Bellinazo, do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal de Pelotas (DCTA – UFPel), da área de microbiologia de alimentos, não consome fora de casa produtos em conserva como palmito, picles e ovos de codorna. Segundo ele, não há como saber quando foram abertos ou como foram armazenados. Assim, existe a possibilidade da presença de Clostridium botulinum. Pedro conta que uma coisa muito comum em Pelotas é a maionese caseira: ela acompanha lanches, pizzas, batata frita e o que mais você imaginar. Esse também é outro receio dele para consumo fora de casa, pois não se sabe o grau de higienização com que foi produzida, se está segura ou não. Mas por incrível que pareça Pedro come sushi sem restrições e também frutas e hortaliças sem lavar.

Stela Avelar, médica veterinária de Belém, não consome alimentos de feiras e mercados, pois ela conhece o cenário e a falta de fiscalização sanitária, já que esses locais não possuem qualidade sanitária na sua infraestrutura e nos alimentos comercializados. Também não consome alimentos oriundos do mar pela alta probabilidade de estarem contaminados.

E você? Conte-nos o que não come fora de casa e por quê.

Agradeço a todos os entrevistados que possibilitaram a criação desta matéria.

3 min leituraDesde a escola, passando pela universidade, trabalho, pelos almoços de domingo na casa dos avós, a comida é o elo entre os humanos. Comemos para celebrar, para esquecer, tem gente […]

Jacqueline Navarro

21 de novembro de 201719 de novembro de 2017

Perigos biológicos

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Atualização da RDC 12 sobre padrões microbiológicos para alimentos

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Você quer saber a quantas andam as ações voltadas para a revisão da RDC 12/2001? Leia este post e se atualize!

Para entrar no rol da atividade da ANVISA, as partes interessadas que se tornaram membros a partir de 2015 solicitaram a participação; que já deveria estar em forma de Consulta Pública (CP), pois a Comissão enviou desde março/abril desse ano a nova proposta, mas devido aos problemas burocráticos/jurídicos da ANVISA, isto ainda não se materializou em CP. Na linha do tempo, as etapas foram: em 1987, Portaria DINAL/MS nº1/87, Portaria SVS 451/97, RDC 12/2001, e agora é esperada a Consulta Pública ainda em 2017.

Primeiramente devemos conceituar o que é “Critério Microbiológico” que segundo a definição Codex Alimentarius é “a aceitabilidade de um produto ou lote de alimentos, com base na ausência ou presença, ou no número de microrganismos, incluindo parasitas, e/ou quantidade de suas toxinas ou metabólitos por unidade(s) de massa, volume, área ou lote”.

Depois devemos nos perguntar sobre o propósito do critério: quais os componentes? E a resposta é através de indicadores de higiene ou um microrganismo alvo. Qual o ponto da cadeia de produção de alimentos? Quais são os limites microbiológicos para o critério e qual o plano de amostragem? Em que se basear para o plano de amostragem: (tamanho/alíquota), nº de amostras entre m e M(c) e a definição do método analítico.

À luz de tudo isso, em que se basearam para a revisão da legislação de microbiologia de alimentos no Brasil? A resposta é: nos regulamentos internacionais, tais como Codex Alimentarius, União Européia, Canadá, Irlanda, Argentina e Hong Kong.

Foram avaliados: âmbito da aplicação, quais microorganismos, as categorias de alimentos (novos produtos e outros alterados, se comparado com a atual versão da Resolução), amostragem, metodologias analíticas e diretrizes para a aplicação da Norma (para os fiscais das VISAs). O grupo técnico foi composto por integrantes do MAPA, universidades, laboratórios, instituto nacional de metrologia, qualidade e tecnologia, fiscalização de alimentos, gerências de laboratórios de saúde pública, ITAL, ABIA e associações do setor produtivo.

Vale ressaltar que como a RDC12 é aplicável para alimentos prontos para oferta ao consumidor (permanecerá esse objetivo) e não estabelece critérios microbiológicos para matérias-primas, ingredientes e aditivos, pois esses possuem normas próprias; sendo considerados indicadores, deteriorantes e patógenos. Não foram considerados microrganismos de importância duvidosa, por ex.: Aeromonas.

As principais alterações que foram propostas nessa revisão:

– escopo da nova Resolução: produtos prontos para consumo até o final do prazo de validade com padrões de segurança e critérios de higiene, ou seja, as indústrias utilizarão a microbiologia preditiva para saber se a validade mantém o padrão até o final da vida útil quanto ao que é sugerido na Lei (mesmo no último dia da validade deve ele ser adequado para o consumo);

– critérios microbiológicos de higiene: indicadores e de segurança: patogênicos e seus metabólitos; não contemplando: micotoxinas, aditivos, coadjuvantes de tecnologia e produtos destinados pós processamento, além da água de abastecimento proveniente de rede pública, também por estar coberta em legislação específica;

– Aplicação da lei é verificada pela autoridade da saúde;

– Alterações em definições para maior esclarecimento;

– Não foi estipulado um tempo para revisão da Resolução;

– Categorização dos alimentos em relação à resolução anterior priorizando dados locais e de epidemiologia e com base em regulamentos internacionais;

– Na RDC atual há um só anexo (C. termotolerantes) com categorias e padrões e na nova haverá dois anexos (similar ao regulamento da UE), contendo critérios de segurança e outro com critérios de higiene (agora deverão enumerar as Enterobactereaceas e E. coli);

– Plano de amostragem é o mesmo de 2 ou 3 classes, mas mudará o “n”, sendo baseado no risco que o microrganismo apresentar baseado no livro 8 da ICMSF – International Commission on Microbiological Specifications. Ex.: amostragem de 3 classes com os resultados: conforme ou marginalmente aceitável ou não conforme, sendo que, quando der marginalmente aceitável, a indústria terá que rever GMP e HACCP;

– Os patógenos novos são: não pesquisar Vibrio parahaemolyticus (pesquisa de gen de virulência – não há laboratório no país todo), B. Cereus hemólise + (presuntivo), inclusa L. monocytogenes além de queijos que já aborda, Cronobacter e C. perfringens (não mais sulfito redutores). L. monocytogenes para produtos prontos para consumo pH › 4,4 e Aw › 0,92. Não pesquisar em self service. Cronobacter apenas para fórmulas infantis para lactantes, destinadas a dietas específicas, fórmulas para recém nascidos. S. Aureus enterotoxinas onde a contagem for alta o laboratório terá que detectar toxinas (enterotoxinas estafilocócica acima de 10⁵UFC/g, mas se for baixa não precisa (pasteurizados/fermentados), principalmente para queijos, leite em pó, requeijão. O C. perfringens deve ser pesquisado diretamente e não sultifo-redutores a 46ºC. Toxinas como histamina em Scombridae (atum, cavala, bonito) que descarboxilam a histidina dando a histamina nos grupos de Enterobacteriaceae maior 50 mg/100g (termoestável e que já consta no Codex Alimentarius utilizado como referência);

– Novas categorias de alimentos: águas envasadas, nozes, amêndoas, cafés e chás para infusão, fórmula para nutrição enteral e fórmulas infantis.

Os desafios para a indústria são entender que os limites são para a comercialização, não podem sair da empresa já com esses limites máximos. Não usar os padrões federais como suas especificações. Para laboratórios de saúde pública entrará Enterotoxinas de Estafilococos, com custo elevado. Em casos de suspeitas de surtos devem pesquisar todos os patógenos (vírus, parasitos) – laboratório deve consultar manual do MS sobre DTA. Indicador de higiene não é patogênico, deve-se pesquisar a E.coli (genes de virulência).

A revisão de novos critérios ou complementares atendendo os progressos de ciência e de tecnologia de alimentos, avaliações de riscos, alterações de microrganismos patogênicos, perfil demográfico dos consumidores (queijo artesanal com leite cru em MG, tipo “queijo da Canastra”, sendo que a Comissão nem discutiu isso, pois é proibido pela legislação da ANVISA), ou seja, não há a definição de tempo.

E você, leitor, o que acha dessas propostas que estão por vir na legislação de microbiologia de alimentos do nosso país? Conte-nos e participe da Consulta Pública quando estiver aberta.

Fonte: SLACA 2017, palestra de Mariza Landgraf da USP.

Imagem: arquivo pessoal da colunista

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Cíntia Malagutti

8 de novembro de 20177 de novembro de 2017

Legislação

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O futuro chegou: dispositivo portátil para detecção de bactérias em alimentos

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Quem nunca sonhou ter um aparelho portátil capaz de fazer detecção de bactérias num alimento pelo simples contato? Um dispositivo sem fios que detectasse a presença de Salmonella, E. coli e de outros microrganismos patogênicos e soasse um alarme em resposta? Ficção científica? Não mais. Estudantes de doutorado em Engenharia de Materiais da Universidade de Auburn, EUA, criaram um dispositivo capaz de fazer isso.

O instrumento tem duas partes: um pequeno sensor (na verdade, um “biossensor magnetoelástico”), que é colocado diretamente sobre a superfície do alimento e um detector para fazer a varredura. O sensor que toca o alimento tem uma membrana revestida com um vírus geneticamente modificado que vai se ligar apenas às bactérias Salmonella typhimurium. O leitor contém uma bobina que cria um campo magnético alternado, para medir a taxa de vibração na membrana. Se houver Salmonella no alimento, ela vai aderir ao vírus e alterar a frequência vibratória, o que é detectado pelo scanner. E, então, soa o alarme.

“O sensor terá um sinal diferente para cada bactéria”, explica Yating Chai, uma das participantes do projeto. Ela e seus colegas cientistas publicaram recentemente os resultados de um estudo de cinco anos para a criação do dispositivo de detecção de bactérias no Journal of Applied Physics. O trabalho deles foi financiado pelo Departamento de Agricultura dos EUA, portanto, há aplicações práticas previstas.

“No futuro qualquer pessoa poderá fazer o teste em sua cozinha. Queremos simplificar todo o processo para que possamos testar diretamente o alimento”, disse ela. Os desenvolvedores do aparelho têm um pedido de patente e uma empresa norte-americana já visitou seus escritórios para discutir a aquisição de uma licença para iniciar sua fabricação.

Quanto a futuras utilizações do biossensor, Yating está pensando grande: “Nos próximos anos, acho que vai ser possível incorporá-lo em telefones celulares ou outros monitores”, disse ela.

Referência e imagem: Food Safety News

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Humberto Soares

5 de novembro de 201316 de agosto de 2023

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