Métodos de análises de alergênicos em alimentos: prós e contras

Já publicamos um post sobre análises de alergênicos em alimentos, baseado em palestra da Conferência Internacional da Eurofins, em 2012. Recentemente, a organização Food Drink Europe divulgou um guia para gestão de alergênicos na indústria de alimentos, com um dos anexos dedicado especialmente aos métodos analíticos, do qual retirei as informações que seguem.

Como a maioria dos alergênicos alimentares são proteínas (exceção para dióxido de enxofre e sulfitos), são elas o objeto primário de detecção dos métodos, que podem ser divididos em 2 grupos: os métodos imunológicos e os métodos de separação de proteínas.

Os métodos imunológicos são baseados em anticorpos, ou seja, um anticorpo similar ao que causa a reação alérgica nos humanos detecta as proteínas no alimento. Os métodos imunológicos típicos são ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ou ensaio de imunoabsorção enzimática) e LFD (Lateral Flow Device ou Dispositivo de Fluxo Lateral), comumente conhecido como tira ou fita reativa (“dipstick”). Os métodos imunológicos estão bem estabelecidos em muitos laboratórios comerciais e são os escolhidos pela indústria e pelos órgãos legisladores devido à sua especificidade e sensibilidade.

Os métodos de separação de proteínas, como a espectrometria de massa (EM), baseiam-se na relação massa/cargas dos íons para fazer a identificação de proteínas ou de seus fragmentos (peptídeos). Por seu custo elevado, são utilizados como método alternativo, para confirmar ou contestar resultados ambíguos obtidos por outros métodos.

Métodos ELISA

Os métodos ELISA, por apresentarem limites de detecção ou quantificação abaixo de mg/kg, são considerados simples, rápidos e de alto rendimento. No entanto, até o momento (outubro de 2013), os kits ELISA validados pela AOAC ou instituições governamentais são apenas os de amendoim (em cereais, biscoitos, sorvetes e chocolate) e avelãs (em cereais, sorvetes e chocolates). Não obstante, muitos outros kits são utilizados rotineiramente pelos laboratórios de alimentos. Os ensaios ELISA apresentam alguns inconvenientes, como o fato de só permitirem analisar um único alergênico por teste, ou seja, se um alimento contém potencialmente 5 alergênicos, vai requerer 5 ensaios diferentes, o que pode significar alto custo analítico. Além disso, várias empresas oferecem kits para o mesmo alergênico, porém com especificidades e sensibilidades ligeiramente diferentes. Isto pode gerar resultados divergentes para a mesma amostra. Na detecção de glúten, por exemplo, os kits ELISA frequentemente dão resultados divergentes. Neste caso, deve-se recorrer aos métodos alternativos, como a espectrometria de massa, para confirmar os resultados.  

Os ensaios ELISA são adequados quando se necessitam de resultados quantitativos, como para validar procedimentos de limpeza e para confirmar os resultados de outros métodos menos confiáveis, como LFD.

Dispositivos de Fluxo Lateral (Lateral Flow Devices, LFD)

Os dispositivos LFD são fitas ou tiras reativas que possibilitam uma detecção rápida e qualitativa do alergênico por técnica imunocromatográfica. O LFD típico é um teste colorimétrico que contém uma linha de controle assegurando a validade do teste e uma linha de prova, que determina a presença/ausência do alergênico, ou seja, só proporciona uma resposta sim/não. Em alguns casos, os resultados podem variar em função do lote de LFD utilizado. Por isso, recomenda-se uma comparação rotineira dos resultados LFD com os resultados ELISA.

Os LFDs são recomendados para checagens rápidas nas linhas de processamento onde se deseja saber se há presença/ausência de algum alergênico específico (limpezas, enxagues) e também para produtos acabados.

Espectrometria de Massa (EM)

A EM pode detectar diretamente as proteínas/peptídeos em baixíssimos níveis, similares aos alcançados por ELISA e PCR. O grande diferencial desta técnica é a capacidade de analisar múltiplos alergênicos num único teste (o chamado “screening”). Outra vantagem é que, ao contrário das tecnologias baseadas em anticorpos, a EM pode detectar mesmo as proteínas que tiverem suas estruturas alteradas pelo processamento industrial, questão importante quando se analisam alimentos altamente processados. Assim como ocorre em outros métodos, deve-se realizar uma validação de cada matriz de alimento para garantir a confiança nos resultados analíticos. A EM também tem a possibilidade de ser semi ou completamente automatizada, permitindo um alto rendimento. Como qualquer metodologia nova, sua aplicação se encontra algo limitada devido ao alto custo dos equipamentos e à necessidade de conhecimentos especializados para o desenvolvimento dos métodos. Importantes fabricantes de equipamentos já estão trabalhando em kits de fácil manejo, o que simplificará o uso da metodologia por parte do usuário.

Métodos baseados na detecção de DNA

A técnica mais conhecida é a PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação em  Cadeia da Polimerase), que amplifica parte de uma sequência específica de DNA. A detecção de alergênicos alimentares por técnicas como esta é controversa, pois não se detecta a substância em si, mas o DNA marcador, que pode ou não ter relação com a quantidade de alergênicos no alimento. Para pesquisar presença de ovo e leite em pó, por exemplo, o método PCR não é confiável.   

A quantidade de DNA na amostra, a presença de compostos que interferem na preparação de DNA, assim como sua qualidade determinam o êxito do ensaio.

Uma vantagem da tecnologia PCR em comparação com ELISA é que todos os componentes do teste estão disponíveis comercialmente e são fáceis de desenvolver. A análise por PCR é a principal alternativa para alguns alergênicos que não dispõe de ensaios ELISA, como o aipo ou salsão, que é considerado alergênico na Europa. Um dos inconvenientes da PCR é que o DNA é altamente instável em meios ácidos, como molho de tomate. Neste caso, deve-se optar por outras técnicas.  Outra questão é a possibilidade de contaminação cruzada nos laboratórios analíticos, pois pequenas quantidades de DNA de ensaios anteriores podem contaminar uma nova amostra e gerar falsos positivos. Os laboratórios que operam equipamentos PCR deveriam ter suas áreas muito bem separadas para garantir uma análise mais confiável.  

Os métodos para análises de alergênicos em alimentos baseados em DNA são recomendados como métodos alternativos quando não se dispõe de outra técnica, ou como informação de apoio para confirmar resultados ELISA/LFD se os níveis de contaminação forem superiores ou iguais a 10 mg/kg (ppm).

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