Embora a Biologia Molecular tenha iniciado seus estudos há aproximadamente 60 anos, foi nas décadas de 80 e 90 do século passado, que foi possível realizar ensaios automatizados para a replicação do DNA “in vitro”.
Patógenos como Salmonella sp, Listeria monocytogenes, E. coli O157, Campylobactr jejuni e Campylobacter coli, Vibrio cholerae e Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus coagulase Positiva, Clostridium botulinum, e alguns outros considerados emergentes são comumente investigados pelo Controle de Qualidade das indústrias produtoras de alimentos no Brasil e no mundo, visto que as exigências e fiscalizações por Órgãos reguladores estão cada vez mais frequentes, principalmente para os países que exportam para EUA, União Européia, Rússia entre outros. Isso fez com que a o diagnóstico por automatização de ensaios microbiológicos para detecção desses microrganismos esteja cada vez mais acessível nos laboratórios, como é o caso de equipamentos que operam por Biologia Molecular.
Hoje diversas técnicas podem ser encontradas no “mercado de patógenos”, como PCR (Reação de Cadeia Polimerase) em Tempo Real. Mas, recentemente uma nova técnica foi lançada, A Amplificação Isotérmica do DNA associada à Detecção por Bioluminescência. Diferentemente da PCR, que amplifica o DNA alvo exponecialmente, a Amplificação Isotérmica têm suas reações contínuas operando a uma única temperatura, o que proporciona um menor custo analítico.
Durante a amplificação, múltiplos primers (estruturas seqüenciais de Bases Nitrogenadas que iniciam as replicações) se alocam simultaneamente em posições específicas do genoma, o que confere a tecnologia uma maior sensibilidade. Além disso, uma enzima mais estável a 60ºC, DNA Polimerase Isotermal, promove a quebra das pontes de hidrogênio das Bases Nitrogenadas e concomitantemente amplifica o DNA.
Ao mesmo tempo em que o DNA é amplificado ocorre também à sua detecção, por isso seu resultado é em tempo real. Diferentemente da PCR que realiza sua detecção por fluorescência, esta nova tecnologia, Amplificação Isotérmica, realiza sua detecção por Bioluminescência, onde um subproduto liberado durante a reação de amplificação, o Pirofosfato, é convertido em APT através de uma reação enzimática entre a ATP Sulfurilase e a Adenosina Fosfosulfato (molécula precursora do ATP). Por sua vez, o ATP produzido reage com a Luciferina/Luciferase produzindo Luz.
A Luz produzida pela reação é mensurada em RLU (Unidade Relativa de Luz) através de um software, que também interpreta o resultado graficamente. Quanto mais luz for produzida na reação, mais DNA do microrganismo alvo está presente na amostra (pré enriquecida) e mais rápido será o resultado POSITIVO, podendo acontecer entre os 15 a 75 minutos de corrida. O resultado Negativo é obtido no final da corrida aos 75 minutos, tempo total de corrida no equipamento.
Além da precisão nos resultados analíticos, esta tecnologia proporciona ao laboratório de Controle de Qualidade resultados mais rápidos, consequentemente uma tomada de ação imediata quando houver problemas com contaminações, uma maior segurança e rapidez na liberação do produto para consumo e/ou laudos para os clientes.
Sylnei Santos
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